VI Brazilian consensus guidelines for detection of anti-cell autoantibodies on HEp-2 cells

Abstract Background: The VI Brazilian Consensus on Autoantibodies against HEp-2 cells for determination of autoantibodies against cellular constituents on HEp-2 cells was held on September, 2019, in Fortaleza (CE, Brazil). The guidelines in this edition were formulated by the group of Brazilian experts discussing the classification of complex patterns, the classification of the nuclear discrete dots (few and multiple), the identification of the discrete fine speckled pattern (AC-4a) and improvements on the ANA report. Mainbody: Sixteen Brazilian researchers and experts from universities and clinical laboratories representing the various geographical regions of Brazil participated in the meeting. Four main topics were discussed: (1) How to classify patterns with fluorescence in more than one cell compartment considering three relevant categoris: composite patterns, mixed patterns and multiple patterns; (2) The splitting of the discrete nuclear dots pattern into the multiple discrete nuclear dots (AC-6) and few discrete nuclear dots (AC-7) patterns, respectively; (3) Inclusion of a novel nuclear pattern characterized by discrete fine speckled pattern highly associated with antibodies to SS-A/Ro60, classified as AC-4a. In addition, adjustments on the Brazilian Consensus nomenclature were implemented aiming to harmonize the designation of some patterns with the International Consensus on ANA Patterns (ICAP). Furthermore, the designations of the PCNA-like pattern (AC-13), CENP-F-like pattern (AC-14) and Topo I-like pattern (AC-29) were adjusted in accordance to ICAP. Finally, there was a recommendation for adjustment in the test report in order to address the status of nuclear envelope staining. For all topics, the aim was to establish specific guidelines for laboratories and clinicians. All recommendations were based on consensus among participants. All recommendations from the V Consensus were maintained and there was relevant progress in the BCA/HEp-2 guidelines and further harmonization with ICAP. Conclusion: The VI BCA/HEp-2 edition was successful in establishing important recommendations regarding the classification of complex patterns, in supporting the identification of a novel pattern within the AC-4 group and in the harmonization process with the ICAP terminology.

Investigation of nerve fibers in the skin by biopsy: technical aspects, indications, and contribution to diagnosis of small-fiber neuropathy

ABSTRACT Skin biopsy with investigation of small-diameter nerve fibers in human epidermis and dermis has been proven to be a useful method for confirming small-fiber neuropathy. In medical practice, small-fiber neuropathy is increasingly recognized as a leading cause of neuropathic pain. It is a prevalent complaint in medical offices, brought by patients often as a "painful burning sensation". The prevalence of neuropathic pain is high in small-fiber neuropathies of different etiologies, especially in the elderly; 7% of population in this age group present peripheral neuropathy. Pain and paresthesia are symptoms which might cause disability and impair quality of life of patients. The early detection of small-fiber neuropathy can contribute to reducing unhealthy lifestyles, associated to higher incidence of the disease.

Performance evaluation of an indirect immunofluorescence kit for the serological diagnosis of dengue / Avaliação do desempenho de kit de imunofluorescência indireta para o diagnóstico sorológico de dengue

ABSTRACT Objective: To evaluate the performance of indirect immunofluorescence for serological diagnosis of dengue virus in a population with high prevalence of arboviruses. Methods: Two-hundred serum samples from patients with clinical suspicion of dengue fever were tested by immunoenzymatic and indirect immunofluorescence assay BIOCHIP® mosaic. Specificity, sensitivity and Kappa coefficient were calculated. Discordant samples were tested by polymerase chain reaction for confirmation. Results: Of the 200 samples, 20% were positive and 80% negative for anti-dengue virus IgM antibodies in the immunoenzymatic test. Of the 40 positives, 25% were negative in indirect immunofluorescence. Of these ten discordant results, only 20% were also negative in the polymerase chain reaction (PCR). Of the 160 negatives in the immunoenzymatic test, 5% were positive in indirect immunofluorescence. Of these nine discordant results, 33% were positive in the PCR. The Kappa coefficient was 0.7 (0.572-0.829). Sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence were respectively 75% and 94%. For anti-dengue virus IgG antibodies, of the 200 samples, 15.5% were positive and 84.5% were negative in the immunoenzymatic test. Of the 31 positives, 12.9% were negative in indirect immunofluorescence. Of these four discordant results, 25% were negative in the PCR. Of the 169 negatives, 8% were positive in indirect immunofluorescence. Of these 14 discordant results, 64% were also positive in the PCR. The Kappa coefficient was 0.695 (0.563-0.83). Sensitivity and specificity of indirect immunofluorescence were 87.1% and 91.7%, respectively. Conclusion: For diagnosis of acute infection, the immunoenzymatic test is enough, and the use of additional methods is not warranted. Replacing the immunoenzymatic test by indirect immunofluorescence would compromise the sensitivity for IgM. However, indirect immunofluorescence can distinguish three arboviruses simultaneously, an advantage during concomitant epidemics.

RESUMO Objetivo: Avaliar o desempenho da imunofluorescência indireta no diagnóstico sorológico de dengue em uma população com alta prevalência de arboviroses. Métodos: Duzentas amostras de soro de pacientes com suspeita clínica de dengue foram testadas por ensaio imunoenzimático e imunofluorescência indireta mosaico BIOCHIP®. Foram calculados especificidade, sensibilidade e coeficiente Kappa. Nas amostras discordantes, realizou-se reação em cadeia da polimerase como método confirmatório. Resultados: Das 200 amostras, 20% foram positivas e 80% negativas para IgM antivírus da dengue no ensaio imunoenzimático. Das 40 positivas, 25% foram negativas na imunofluorescência indireta. Destas dez negativas, apenas 20% eram também negativas na reação em cadeia da polimerase. Das 160 negativas no ensaio imunoenzimático, 5% foram positivas na imunofluorescência indireta. Por fim, dentre as nove discordantes, 33% tiveram vírus da dengue detectado na reação em cadeia da polimerase. O coeficiente Kappa foi 0,70 (0,57-0,82). Sensibilidade e especificidade por imunofluorescência indireta foram, respectivamente, 75% e 94%. Para IgG antivírus da dengue, de 200 amostras, 15,5% foram positivas e 84,5% negativas no ensaio imunoenzimático. Das 31 positivas, 12,9% foram negativas na imunofluorescência indireta. Destas quatro discordantes, 25% apresentaram vírus da dengue não detectado na reação em cadeia da polimerase. Das 169 negativas, 8% foram positivas na imunofluorescência indireta. Destas, 64% foram positivas também na reação em cadeia da polimerase. O coeficiente Kappa foi 0,695 (0,56-0,83). Sensibilidade e a especificidade por imunofluorescência indireta foram, respectivamente, 87,1% e 91,7%. Conclusão: Ensaio imunoenzimático seria suficiente para diagnóstico sorológico de infecção aguda, não justificando a incorporação da imunofluorescência indireta. Substituir ensaio imunoenzimático pela imunofluorescência indireta poderia comprometer a sensibilidade para IgM. Contudo, a imunofluorescência indireta auxilia diferenciar três arboviroses simultaneamente, sendo vantajoso em epidemias concomitantes.

Comparison between enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence for detection of antineutrophil cytoplasmic antibodies / Comparação entre os métodos de ensaio imunoenzimático e imunoflurescência indireta para a pesquisa de anticorpos anticitoplasma de neutrófilos

ABSTRACT Objective To evaluate the performance of enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluorescence methods for the detection of antineutrophil cytoplasmic antibodies in a routine clinical laboratory setting. Methods A total of 227 samples were tested by indirect immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assay with antigen specificity for antiproteinase 3 and antimyeloperoxidase. The proportions of positive samples were compared by McNemar hypotheses and agreement was described by Cohen's Kappa coefficient. Results The agreement of the tests was 96.5%, and the Kappa coefficient obtained was 0.70 (95%CI: 0.50-0.90; p<0.001). Considering indirect immunofluorescence as the gold standard, the sensitivity of the enzyme-linked immunosorbent assay was 0.62 and the specificity was 0.99, with diagnostic accuracy in 96% of cases. Some samples were negative in enzyme-linked immunosorbent assay and positive in indirect immunofluorescence. This situation occurred in all immunofluorescence patterns, but particularly in atypical patterns. Two samples with antiproteinase 3 positivity were considered negative in indirect immunofluorescence. Conclusion The enzyme-linked immunosorbent assay had high specificity but lower sensitivity. The performance of indirect immunofluorescence increases diagnostic sensitivity, while the search for antiproteinase 3 by enzyme-linked immunosorbent assay may also add diagnostic power.

RESUMO Objetivo Avaliar o desempenho das metodologias de ensaio imunoenzimático e imunofluorescência indireta para a detecção de anticorpos anticitoplasma de neutrófilos em um contexto de laboratório clínico de rotina. Métodos Foram testadas 227 amostras pelas metodologias de imunofluorescência indireta e ensaio imunoenzimático com especificidades para anticorpos antiproteinase-3 e antimieloperoxidase. As proporções de amostras positivas foram comparadas por hipóteses de McNemar, e a concordância foi descrita pelo coeficiente Kappa de Cohen. Resultados A concordância dos testes foi 96,5%, e o coeficiente Kappa obtido foi 0,70 (IC95%: 0,50-0,90; p<0,001). Utilizando a imunofluorescência indireta como padrão-ouro, a sensibilidade do ensaio imunoenzimático foi de 0,62 e a especificidade, 0,99, com acurácia diagnóstica em 96% dos casos. Algumas amostras apresentaram resultados negativos por ensaio imunoenzimático e positivos por imunofluorescência. Isso ocorreu em amostras com vários padrões de fluorescência, mas particularmente nos casos com padrões atípicos. Duas amostras com positividade antiproteinase 3 foram consideradas negativas por imunofluorescência. Conclusão Os métodos de ensaio imunoenzimático tiveram alta especificidade, mas sensibilidade inferior. A realização da imunofluorescência indireta aumenta a sensibilidade diagnóstica, ao mesmo tempo que a pesquisa de antiproteinase 3 por ensaio imunoenzimático também pode agregar poder diagnóstico.

V Brazilian consensus guidelines for detection of anti-cell autoantibodies on hep-2 cells

Abstract Background: The V Brazilian Consensus for determination of autoantibodies against cellular constituents on HEp-2 cells, held in Brasilia (DF, Brazil) on August 27, 2016, discussed the harmonization between the Brazilian Consensus on ANA (BCA) guidelines and the International Consensus on ANA Patterns (ICAP) recommendations (www.anapatterns.org). Initial guidelines were formulated by the group of Brazilian experts with the purpose of guiding and enabling Brazilian clinical laboratories to adopt recommendations and to provide a common standard for national and international consensuses. Mainbody: Twenty Brazilian researchers and experts from universities and clinical laboratories representing the various geographical regions of the country participated in the meeting. Three main topics were discussed, namely the harmonization between the BCA guidelines and latest recommendations of the ICAP initiative, the adjustment of the terminology and report on HEp-2 patterns, and a reassessment of quality assurance parameters. For the three topics, our aim was to establish specific guidelines. All recommendations were based on consensus among participants. There was concrete progress in the adjustment of the BCA guidelines to match the ICAP guidelines. To a certain extent, this derives from the fact that ICAP recommendations were largely based on the algorithm and recommendations of the IV Brazilian ANA Consensus, as consistently recognized in the ICAP publications and presentations. However, although there is great overlap between the two Consensuses, there are some point divergences. These specific items were individually and extensively discussed, and it was acknowledged that in several points ICAP improved recommendations previously issued by the Brazilian ANA Consensus and these changes were readily implemented. Regarding some specific topics, the BCA panel of experts felt that the previously issued recommendations remained relevant and possibly will require further discussion with ICAP. The term anti-cell antibodies was adopted as the recommended designation, recognizing that the assay addresses antibodies against antigens in the nucleus and in other cell compartments. However, the acronym ANA HEp-2 was maintained due to historical and regulatory reasons. It was also signalized that the latest trend in ICAP is to adopt the term Indirect Immunofluorescent Assay on HEp-2 cell substrate (HEp-2 IIFA). In addition, the quality assurance strategies previously presented were ratified and emphasized. Conclusion: The V BCA edition was successful in establishing an overall harmonization with the ICAP recommendations for interpretation of the HEp-2 IIFA test, pinpointing the perspectives in filling the remaining gaps between both initiatives.

The cerebrospinal fluid in multiple sclerosis: far beyond the bands / O líquido cefalorraquidiano na esclerose múltipla: muito além das bandas

ABSTRACT The cerebrospinal fluid analysis has been employed for supporting multiple sclerosis diagnosis and ruling out the differential diagnoses. The most classical findings reflect the inflammatory nature of the disease, including mild pleocytosis, mild protein increase, intrathecal synthesis of immunoglobulin G, and, most typically, the presence of oligoclonal bands. In recent years, new biomarkers have emerged in the context of multiple sclerosis. The search for new biomarkers reflect the need of a better evaluation of disease activity, disease progression, and treatment efficiency. A more refined evaluation of disease and therapy status can contribute to better therapeutic choices, particularly in escalation of therapies. This is very relevant taking into account the availability of a greater number of drugs for multiple sclerosis treatment in recent years. In this review, we critically evaluate the current literature regarding the most important cerebrospinal fluid biomarkers in multiple sclerosis. The determination of biomarkers levels, such as chemokine ligand 13, fetuin A, and mainly light neurofilament has shown promising results in the evaluation of this disease, providing information that along with clinical and neuroimaging data may contribute to better therapeutic decisions.

RESUMO A análise do líquido cefalorraquidiano tem sido empregada para avaliação diagnóstica da esclerose múltipla e a exclusão dos diagnósticos diferenciais. Os achados clássicos refletem a natureza inflamatória da doença, incluindo discreta pleocitose, leve hiperproteinorraquia, aumento da síntese intratecal de imunoglobulina G e, mais tipicamente, a presença de bandas oligoclonais. Nos últimos anos, surgiram novos biomarcadores para esclerose múltipla, e esta busca por marcadores reflete a necessidade de melhor avaliar a atividade e a progressão da doença, bem como a eficácia terapêutica. Uma avaliação mais refinada da atividade da doença e da resposta aos medicamentos pode contribuir para melhores decisões terapêuticas, particularmente no que se refere à troca de medicação. Isto é muito importante nos dias de hoje, quando surgem novas opções medicamentosas. Neste artigo de revisão, avaliamos criticamente a literatura atual referente aos novos marcadores liquóricos na esclerose múltipla. A mensuração destes marcadores, como a quimiocina CXCL13, fetuína A e, principalmente, o neurofilamento de cadeia leve, demonstrou resultados promissores na avaliação da doença, provendo informações que, em conjunto com dados clínicos e de neuroimagem, podem contribuir para melhores decisões terapêuticas.

Personalized medicine and the clinical laboratory / Medicina personalizada e o laboratório clínico

Personalized medicine is the use of biomarkers, most of them molecular markers, for detection of specific genetic traits to guide various approaches for preventing and treating different conditions. The identification of several genes related to heredity, oncology and infectious diseases lead to the detection of genetic polymorphisms that are involved not only in different clinical progression of these diseases but also in variations in treatment response. Currently, it is possible to detect these polymorphisms using several methodologies: detection of single nucleotide polymorphisms using polymerase chain reaction methods; nucleic acid microarray detection; and nucleic acid sequencing with automatized DNA sequencers using Sanger-derived methods and new generation sequencing. Personalized medicine assays are directed towards detecting genetic variations that alter interactions of drugs with targets or the metabolic pathways of drugs (upstream and downstream) and can be utilized for the selection of drug formulations and detect different immunogenicities of the drug. Personalized medicine applications have already been described in different areas of Medicine and allow specific treatment approaches to be applied to each patient and pathology according to the results of these assays. The application of such a protocol demands an increasing interaction between the clinical laboratory and the clinical staff. For its implementation, a coordinated team composed of basic researchers and physicians highly specialized in their areas supported by a highly specialized team of clinical analysts particularly trained in molecular biology assays is necessary.

Medicina personalizada é o uso de biomarcadores, em sua maioria marcadores moleculares, para a detecção de traços genéticos específicos, a fim de orientar diversas abordagens para a prevenção e o tratamento de diferentes doenças. A identificação de vários genes relacionados a doenças hereditárias, oncológicas e infecciosas permite a detecção de polimorfismos genéticos que estão envolvidos em diferentes evoluções clínicas dessas doenças, bem como com variações na resposta ao tratamento. Atualmente, já é possível detectar esses polimorfismos utilizando diversas metodologias: a detecção de polimorfismos de nucleotídeo único pela reação de polimerização em cadeia; a detecção de microarranjos de ácidos nucleicos; e o sequenciamento de ácidos nucleicos com sequenciadores de DNA automatizados usando métodos derivados de sequenciamento Sanger ou de nova geração. Os ensaios de medicina personalizada são dirigidos para detectar variações genéticas que alteram interações de fármacos com alvos ou vias metabólicas de fármacos (anabólicas e catabólicas), podendo ser utilizados para a seleção de formulações farmacêuticas e para detectar diferentes imunogenicidades da droga. As aplicações de medicina personalizada já foram descritas em várias áreas da Medicina e permitem que abordagens de tratamento específicas sejam aplicadas para cada paciente e para cada doença, de acordo com os resultados dos ensaios utilizados. A aplicação de um protocolo desse tipo exige uma relação intensa entre o laboratório e o corpo clínico. Para sua execução, é necessária uma equipe coordenada, composta por investigadores de pesquisa básica e médicos altamente especializados em suas áreas, apoiada por um time bastante especializado de analistas clínicos treinados em testes de biologia molecular.

Anticorpos anti-C1q e sua correlação com atividade do lúpus eritematoso sistêmico / Anti-C1q antibodies and systemic lupus erythematosus activity

JUSTIFICATIVA E OBJETIVO: Anticorpos Anti-C1q têm sido fortemente associados a envolvimento renal por lúpus eritematoso sistêmico. A principal hipótese para explicar a patogênese dos anticorpos anti-C1q no lúpus eritematoso sistêmico é a de que a doença é exacerbada por um decréscimo na depuração de células apoptóticas. O objetivo deste estudo foi verificar a associação entre títulos séricos de anti-C1q em portadores de lúpus eritematoso sistêmico, quanto à atividade da doença e quanto às suas manifestações clínicas, com ênfase para manifestações renais. MÉTODOS: Estudo de corte transversal realizado com 62 pacientes com diagnóstico recente de lúpus eritematoso sistêmico, quanto à presença ou não de autoanticorpos anti-C1q no soro, no período de junho a dezembro de 2012. Os critérios clínicos utilizados para caracterizar nefrite lúpica foram: (1) anormalidades ao sumário de urina, como proteinúria de 24 horas >500mg/24 horas ou (2) cilindrúria (cilindros granulosos, hemáticos ou leucocitários), ou (3) aumento da creatinina sérica em relação à creatinina imediatamente anterior >50%. RESULTADOS: A amostra foi constituída predominantemente por mulheres jovens e afrodescendentes. Observou-se que os títulos de anti-C1q se associaram à atividade de lúpus eritematoso sistêmico de maneira geral, uma vez que a correlação de Sperman apresentou correlação moderada positiva entre o escore Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) e a titulação de anti-C1q sérico...

BACKGROUND AND OBJECTIVE: Anti-C1q antibodies have been strongly associated with renal involvement in systemic lupus erythematosus. The main hypothesis to explain the pathogenesis of anti-C1q antibodies in systemic lupus erythematosus is that the condition is exacerbated by a decrease in the clearance of apoptotic cells. This study aimed to assess the association between serum titers of anti-C1q with activity systemic lupus erythematosus and with its clinical manifestations, with emphasis on renal manifestations. METHODS: This was a cross-sectional study conducted on 62 patients with newly diagnosed systemic lupus erythematosus for the presence or absence of anti-C1q autoantibodies in serum, in the period June to December 2012. The clinical criterioa used to characterize lupus nephritis were: (1) presence of proteinuria 24 hours >500mg/24 hours, or (2) urinary casts (granular cylinders, hematic or leukocyte), or (3) increased serum creatinine >50% related to the basal levels. RESULTS: The sample was mainly constituted by young females and afrodescendent. We observed that the titers of anti-C1q were associated with the activity of systemic lupus erythematosus in general, since the Spearman correlation showed moderate positive correlation between the Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index (SLEDAI) score and the titration of anti-C1q serum...

SeptiFast for diagnosis of sepsis in severely ill patients from a Brazilian hospital / Uso do SeptiFast para diagnóstico de sepse em doentes graves de um hospital brasileiro

Objective To test and validate a multiplex real-time polymerase chain reaction method for bloodstream infections, as well as to compare the results with conventional blood culture. Methods A total of 114 consecutive patients with clinical evidence of sepsis were submitted to blood culture and LightCycler™ SeptiFast tests. Results More positive specimens (23; 20.2%) were detected using the LightCycler™ SeptiFast than the blood culture (17; 14.9%), with an agreement of 86.8%. Discordant results were seen in four patients positive only to blood culture, ten positive only to LightCycler™ SeptiFast and one to different pathogens found by each test. Infections with microorganisms detected only using blood culture reassured the need to perform both tests. The mean time to results for blood culture was 5 days for negative and 3.5 days for positive results. LightCycler™ SeptiFast results were achieved in less than 8 hours. Conclusion LightCycler™ SeptiFast showed a high potential as a test to be carried out concomitantly with blood culture for sepsis diagnosis in severely ill patients. This test allowed a faster diagnosis of bacterial and fungal infections that helped to reduce hospital stay and to control the use of antibiotics. LightCycler™ SeptiFast can also eventually detect microorganism and infections that are hardly detected by blood culture, especially Candida non-albicans infections. .

Objetivo Testar e validar um método molecular multiplex para detecção de infecções sanguíneas, além de comparar os resultados com os obtidos pela hemocultura convencional. Métodos Os testes de hemocultura e o LightCycler® SeptiFast foram realizados em 114 pacientes consecutivos com evidência clínica de sepse. Resultados Mais amostras positivas (23; 20,2%) foram detectadas pelo LightCycler® SeptiFast do que pela hemocultura (17; 14,9%), mostrando concordância de 86,8%. Os resultados discordantes foram de quatro pacientes positivos apenas para hemocultura, dez positivos apenas para LightCycler® SeptiFast e um com patógenos diferentes encontrados em cada método. Infecções por micro-organismos não reconhecidos pelo LightCycler® SeptiFast e detectados apelas pela hemocultura confirmam a necessidade da realização dos dois métodos. O tempo médio para os resultados da hemocultura foi de 5 dias para amostras negativas e de 3,5 dias para as positivas. Os resultados pelo LightCycler® SeptiFast foram obtidos em menos de 8 horas. Conclusão O LightCycler® SeptiFast mostrou ser um teste de grande potencial para ser realizado simultaneamente à hemocultura para diagnóstico de sepse em doentes graves, permitindo um diagnóstico mais rápido de infecções por bactérias e fungos e, dessa forma, auxiliando a redução do tempo de hospitalização e racionalização do uso de antibióticos. Eventualmente, o LightCycler® SeptiFast pode detectar inclusive infecções por micro-organismos dificilmente detectáveis via hemocultura, especialmente aquelas causadas por Candida não albicans. .

IV Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em celulas HEp-2 / IV Brazilian Guidelines for autoantibodies on HEp-2 cells

Objetivo: O IV Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2 (FAN) realizado em Vitória (ES), no dia 18 de setembro de 2012, objetivou discutir estratégias e recomendações relacionadas ao procedimento técnico, à padronização e à interpretação dos resultados da pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2. Métodos: Participaram do evento 23 pesquisadores e especialistas de Universidades e laboratórios brasileiros. Foram abordados diferentes tópicos, discutidos amplamente a fim de se estabelecer recomendações específicas. Resultados e conclusão: O IV Consenso integrou à árvore de decisão o padrão citoplasmático em Anéis e Bastões, o padrão nuclear pontilhado Quasi-homogêneo (QH) e o padrão misto CENP-F. Discutiu-se ainda a necessidade de atenção para a classificação do padrão misto relacionado à presença de anticorpos anti-DNA topoisomerase I (Scl70), compreendendo os componentes nuclear pontilhado fino, nucleolar homogêneo, NOR na placa metafásica e citoplasmático pontilhado fino. Foram sugeridas diretrizes para o controle de qualidade do teste, diluição de triagem e diluição de esgotamento, e foi emitido alerta quanto à necessidade de atenção em relação à heterogeneidade de substratos disponíveis no mercado e a utilização de metodologias automatizadas para detecção de autoanticorpos. .

Objective: The Fourth Brazilian Consensus for Autoantibodies Screening in HEp-2 Cells (ANA) was held in Vitória, Espírito Santo, and aimed to discuss strategies and recommendations about the technique, standardization, interpretation and quality control of the indirect immunofluorescence reaction on HEp-2 cells. Methods: Twenty three ANA experts from university centers and private laboratories in different areas from Brazil discussed and agreed upon recommendations for the fourth edition of the Brazilian Consensus for Autoantibodies Screening in HEp-2 Cells. Results and conclusion: The 4th ANA Consensus included three novel patterns into the existing algorithm (cytoplasmic Rods and Rings, nuclear Quasi-homogeneous, and CENP-F). Emphasis was given to the need of attention in describing the peculiar mixed pattern elicited by anti-DNA topoisomerase I (Scl-70) autoantibodies, comprising nuclear fine specked, nucleolar homogeneous pattern, NOR staining in metaphase plates, and cytoplasmic fine speckled patterns. The group also emphasized the need for continuous quality control in indirect immunofluorescence assays, the establishment of screening dilutions, as well as conjugate titration. An alert was made regarding the heterogeneity of commercial kits in defining patterns and the use of solid phase methodologies to determine the presence of autoantibodies. .

Variability in the recognition of distinctive immunofluorescence patterns in different brands of HEp-2 cell slides / Variabilidade no reconhecimento de padrões de imunofluorescência indireta em diferentes marcas de lâminas HEp-2

INTRODUCTION: Indirect immunofluorescence on HEp-2 cells is considered the gold standard for the detection of autoantibodies against cellular antigens. However, the culture conditions, cell fixation and permeabilization processes interfere directly in the preservation and spatial distribution of antigens. Therefore, one can assume that certain peculiarities in the processing of cellular substrate may affect the recognition of indirect immunofluorescence patterns associated with several autoantibodies. OBJECTIVE: To evaluate a panel of serum samples representing nuclear, nucleolar, cytoplasmic, mitotic apparatus, and chromosome plate patterns on HEp-2 cell substrates from different suppliers. MATERIALS AND METHODS: Seven blinded observers, independent from the three selected reference centers, evaluated 17 samples yielding different nuclear, nucleolar, cytoplasmic and mitotic apparatus patterns on HEp-2 cell slides from eight different brands. The slides were coded to maintain confidentiality of both brands and participating centers. RESULTS: The 17 HEp-2 cell patterns were identified on most substrates. Nonetheless, some slides showed deficit in the expression of several patterns: nuclear coarse speckled/U1-ribonucleoprotein associated with antibodies against RNP (U1RNP), centromeric protein F (CENP-F), proliferating cell nuclear antigen (PCNA), cytoplasmic fine speckled associated with anti-Jo-1 antibodies (histidyl synthetase), nuclear mitotic apparatus protein 1 (NuMA-1) and nuclear mitotic apparatus protein 2 (NuMA-2). CONCLUSION: Despite the overall good quality of the assessed HEp-2 substrates, there was considerable inconsistency in results among different commercial substrates. The variations may be due to the evaluated batches, hence generalizations cannot be made as to the respective brands. It is recommended that each new batch or new brand be tested with a panel of reference sera representing the various patterns.

INTRODUÇÃO: A imunofluorescência indireta (IFI) utilizando células HEp-2 como substrato antigênico é o teste padrão-ouro para a pesquisa de autoanticorpos contra antígenos celulares. Contudo, as condições de cultivo, fixação e permeabilização celular interferem diretamente na preservação e na distribuição espacial dos antígenos. Portanto, pode-se presumir que distintas condições no preparo das células possam interferir no reconhecimento dos padrões de imunofluorescência associados aos diversos autoanticorpos. OBJETIVO: Avaliar um painel de amostras de soro representativo de padrões nuclear, nucleolar, citoplasmático, de aparelho mitótico e de placa cromossômica em substratos de células HEp-2 de diferentes fornecedores. MATERIAIS E MÉTODOS: Sete observadores blindados e independentes de três centros de referência avaliaram 17 amostras que apresentavam diferentes padrões nucleares, nucleolares, citoplasmáticos e associados ao aparelho mitótico em lâminas com células HEp-2 de oito procedências. As lâminas foram codificadas para manter a confidencialidade das marcas, bem como dos centros participantes. RESULTADOS: Os 17 padrões de imunofluorescência em células HEp-2 foram reconhecidos na maioria dos substratos. No entanto, alguns substratos mostraram déficit na apresentação de alguns padrões (nuclear pontilhado grosso/U1-ribonucleoprotein associado a anticorpos contra o RNP (U1 ribonucleoproteína), sugestivo da presença de anticorpos anti-CENP-F (proteína centromérica F), sugestivo de anticorpos contra antígenos de célula em proliferação (proliferating cell nuclear antigen [PCNA]), citoplasmático pontilhado fino associado a anticorpos anti-Jo-1 (histidil sintetase), anti-NuMA-1 (nuclear mitotic apparatus protein 1) e anti-NuMA-2 (nuclear mitotic apparatus protein 2). CONCLUSÃO: Em que pese a boa qualidade geral dos substratos avaliados, existe divergência nos resultados obtidos entre os diferentes substratos comerciais. As variações observadas podem ser devidas aos lotes avaliados, portanto não se pode generalizar para as respectivas marcas. Recomenda-se que cada novo lote ou marca de lâmina sejam testados com diferentes soros referência representativos dos diversos padrões.

PCSK9 and its clinical importance with the new therapeutic targets against dyslipidemia / A PCSK9 e sua relevância clínica com os novos alvos terapêuticos contra a dislipidemia

This is a remarkable progress; since the finding of statins, there was no new way of reducing, significantly, cholesterol and LDL fraction. It is also clear that this decrease, by statins, is related to future cardiovascular lesions, being useful in its primary and secondary prophylaxis. The authors presented studies on research to promote the falling of blood cholesterol by means of antibodies, which inhibit the pro-protein PCSK9, as well as agents that act performing the RNA interference. We had two advantages immediately: for patients with myopathy associated with statins, and the fact of being injected every 15 days, that may contribute to better treatment adherence.

Este é um progresso sensível; desde a descoberta das estatinas, não havia novas maneiras de diminuir, de maneira significativa, o colesterol e a fração LDL. Também está claro que essa redução, pelas estatinas, tem relação com futuras lesões cardiovasculares, sendo útil na profilaxia primária e secundária destas. Os autores apresentaram estudos sobre pesquisas para promover a queda do colesterol sanguíneo por meio de anticorpos que inibem a pró-proteína PCSK9, bem como agentes que atuam realizando a interferência no RNA. Duas vantagens se afiguram imediatamente: para pacientes que têm a miopatia relacionada às estatinas e por ser droga injetável a cada 15 dias, o que pode colaborar para maior adesão ao tratamento.

Correlação entre citometria de fluxo e anatomia patológica: experiência de dez anos na investigação de doenças linfoproliferativas / Correlation between flow cytometry and histologic findings: ten year experience in the investigation of lymphoproliferative diseases

Objetivo: Evidenciar as vantagens da correlação entre imunofenotipagem por citometria de fluxo e exame anatomopatológico/imunoistoquímico de adenomegalias e/ou nódulos no diagnóstico de doenças linfoproliferativas. Métodos: Estudo retrospectivo no qual foram avaliadas 157 amostras de biópsias ou punções aspirativas de gânglios ou nódulos de 142 pacientes, durante o período de 1999 a 2009. As amostras tinham sido encaminhadas simultaneamente para os Serviços de Citometria de Fluxo e Anatomia Patológica do Hospital Israelita Albert Einstein, em São Paulo. Para a análise na anatomia patológica, as amostras foram preparadas em lâminas e coradas com hematoxilina-eosina, Giemsa, ou marcadas com anticorpos monoclonais para detecção de antígenos específicos. Para a análise por imunofenotipagem por citometria de fluxo, as amostras foram hemolisadas e marcadas com diferentes painéis de anticorpos monoclonais para detecção dos diferentes antígenos. Resultados: Foram concordantes os diagnósticos entre a anatomopatológico e imunofenotipagem por citometria de fluxo em 115 (81%) pacientes, o que correspondeu a 127 amostras distribuídas da seguinte forma, conforme o diagnóstico anatomopatológico: 63 pacientes com linfoma não Hodgkin de células B; 26 pacientes com hiperplasia linfoide reacional; 5 pacientes com linfoma não Hodgkin de células T; 4 pacientes com proliferação linfoide atípica; 5 pacientes com processo inflamatório crônico granulomatoso; 5 pacientes com diagnósticos não hematológicos; 2 pacientes com sarcoma granulocítico; 2 pacientes com timoma; 1 paciente com leucemia bifenotípica; 1 paciente com plasmocitoma Kappa; e 1 paciente com linfoma de Hodgkin. A correlação entre os resultados das duas técnicas permitiu a classificação dos subtipos de linfomas da seguinte forma: 19 pacientes com linfoma folicular; 15 pacientes com linfoma difuso de grandes células B; 7 pacientes com linfoma linfocítico de pequenas células B/leucemia linfocítica crônica; 3 pacientes com linfoma de células do manto; 1 paciente com linfoma de Burkitt; 1 paciente com linfoma do tipo MALT (tecido linfoide associado à mucosa); 1 paciente com doença linfoproliferativa pós-transplante; 2 pacientes com linfoma não Hodgkin de células B de alto grau; 1 paciente com linfoma não Hodgkin de células B de baixo grau; 1 paciente linfoma de Hodgkin; e 12 pacientes com linfoma não Hodgkin de células B, sem outra especificação. Conclusão: A imunofenotipagem por citometria de fluxo complementa os achados do estudo anatomopatológico/imunoistoquímico, permitindo um diagnóstico hematopatológico rápido e preciso das doenças linfoproliferativas.

Full-length genomic sequence of hepatitis B virus genotype C2 isolated from a native Brazilian patient

The hepatitis B virus (HBV) is among the leading causes of chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In Brazil, genotype A is the most frequent, followed by genotypes D and F. Genotypes B and C are found in Brazil exclusively among Asian patients and their descendants. The aim of this study was to sequence the entire HBV genome of a Caucasian patient infected with HBV/C2 and to infer the origin of the virus based on sequencing analysis. The sequence of this Brazilian isolate was grouped with four other sequences described in China. The sequence of this patient is the first complete genome of HBV/C2 reported in Brazil.

III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2: perspectiva histórica, controle de qualidade e associações clínicas / Third Brazilian Consensus for Autoantibodies Screening in HEp-2 Cells: historical perspective, quality control and clinical associations

OBJETIVO: O III Consenso Brasileiro para Pesquisa de Autoanticorpos em Células HEp-2 (FAN) objetivou discutir estratégias para controlar a qualidade do ensaio, promover a atualização das associações clínicas dos diversos padrões e avaliar as dificuldades de implantação do II Consenso ocorrido no ano de 2002. MÉTODOS: Nos dias 13 e 14 de abril de 2007 participaram do encontro em Goiânia pesquisadores e especialistas de diversos centros universitários e laboratórios clínicos de diferentes regiões do Brasil, com o propósito de discutir e aprovar as recomendações que visam a melhores padronização, interpretação e utilização do ensaio pelos clínicos. Foram convidados como ouvintes representantes comerciais de diferentes empresas produtoras de insumos para realização do teste de FAN. RESULTADOS E CONCLUSÃO: Dada a heterogeneidade de microscópios e reagentes disponíveis no mercado, o III Consenso enfatizou a necessidade do controle de qualidade em ensaios de imunofluorescência indireta. Foram também feitas algumas adequações na terminologia utilizada para classificar os diferentes padrões. Finalmente, foi realizada uma atualização das associações clínicas com finalidade de facilitar cada vez mais o melhor uso do ensaio pelos clínicos.

OBJECTIVE: The Third Brazilian Consensus for Autoantibodies Screening in HEp-2 Cells (ANA) had as purpose the evaluation of difficulties in the accomplishment of the 2nd Consensus recommendations that took place in the year of 2002, the discussion of strategies for quality control of the assay and the discussion of an update of the clinical associations of the several immunofluorescent patterns. METHODS: Several ANA experts from university centers and private laboratories in different areas in Brazil joined the workshop in Goiânia on 2007 April 13 and 14 with the purpose of discussing and approving the recommendations for standardization, interpretation and use of the test by physicians. Commercial representatives of different ANA slide brands were also invited as listeners to the workshop. RESULTS AND CONCLUSION: The 3rd ANA Consensus emphasized the need for quality control in indirect immunofluorescent assays since there is a considerable heterogeneity of available microscopes and reagents. It also promoted adaptations in the previously approved terminology used to classify the different patterns and finally updated the clinical associations of the several patterns with the purpose of providing guidance for interpretation of the assay by clinical pathologists and assistant physicians.

3º Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2 (FAN): recomendações para padronização do ensaio de pesquisa de autoanticorpos em células HEp-2, controle de qualidade e associações clínicas / Third Brazilian Consensus for autoantibodies screening in HEp-2 cells (ANA): recommendations for standardization of autoantibodies screening trial in HEp-2 cells, quality control and clinical associations

OBJETIVO: O 3º Consenso Brasileiro para pesquisa de autoanticorpos em Células HEp-2 (FAN) teve como propósito avaliar as dificuldades de implantação do 2º Consenso ocorrido no ano de 2002, discutir estratégias para controlar a qualidade do ensaio e promover a atualização das associações clínicas dos diversos padrões. MÉTODOS: Participaram do encontro em Goiânia nos dias 13 e 14 de abril de 2008 pesquisadores e especialistas de diversos centros universitários e laboratórios clínicos de diferentes regiões do Brasil, com o propósito de discutir e aprovar as recomendações que visam à melhor padronização, interpretação e utilização do ensaio pelos clínicos. Representantes comerciais de diferentes empresas produtoras de insumos para realização do teste de FAN foram convidados como ouvintes. RESULTADOS E CONCLUSÕES: O 3º Consenso enfatizou a necessidade do controle de qualidade em imunofluorescência dada a heterogeneidade de microscópios e reagentes disponíveis no mercado, promoveu adequações na terminologia utilizada para classificar os diferentes padrões e, finalmente, atualizou as associações clínicas com finalidade de facilitar cada vez mais o melhor uso do ensaio pelos clínicos.

OBJECTIVE: The Third Brazilian Consensus for autoantibodies Screening in HEp-2 cells had as purpose the evaluation of difficulties in the accomplishment of the 2nd Consensus recommendations that took place in the year of 2002, the discussion of strategies for quality control of the assay and the promotion of an update of the clinical associations of the several immunofluorescent patterns. METHODS: Several ANA experts from university centers and private laboratories in different areas in Brazil joined the workshop in Goiânia on 2008 April 13 and 14 with the purpose of discussing and approving the recommendations for standardization, interpretation and use of the test by physicians. Commercial representatives of different ANA slide brands were also invited as listeners to the workshop. RESULTS AND CONCLUSIONS: The 3rd Consensus emphasized the need for quality control in indirect immunofluorescent since there is a considerable heterogeneity of available microscopes and reagents. It also promoted adaptations in the previously approved terminology used to classify the different patterns and finally updated the clinical associations of the several patterns with the purpose of providing guidance for interpretation of the assay by clinical pathologists and assistant physicians.

Citometria de fluxo: Imunofenotipagem em 48 casos de leucemia de células cabeludas e a relevância das intensidades de fluorescências nas expressões dos anticorpos monoclonaispara o diagnóstico / Flow cytometry: Immunophenotyping in 48 hairy cell leukemia cases and the relevance of fluorescence intensity in CDs expression for diagnosis

Objetivo: Relatar a experiência e importância da imunofenotipagem porcitometria de fluxo através da positividade e intensidade de expressões antigênicas no diagnóstico de 48 pacientes com leucemia de células cabeludas. Métodos: Entre novembro de 1991 e junho de 2005, 4.318 casos foram analisados por citometria de fluxo, sendo 3.556 pacientescom doenças oncoematológicas (82,3%) e diagnosticados 48 casos(1,3%) de leucemia de células cabeludas. As análises morfológicas foram realizadas em lâminas coradas pelo método pancromático MayGrunwald Giemsa, por pelo menos dois experientes morfologistas.As análises citoquímicas realizadas foram fostatase ácida e fosfataseácida inibida por tartarato (TRAP). Foram analisadas as expressões antigênicas dos anticorpos monoclonais: CD2, CD3, CD5, CD7, CD10,CD11c, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD38, HLA-DR, FMC-7,CD79b, CD103, IgM, IgG, IGD, Kappa e Lambda. Resultados: Através das análises dos porcentuais de positividade e intensidade deexpressão dos anticorpos monoclonais encontrados nas regiões de células dos histogramas de volume e complexidade (utilizado de 1991a outubro de 2001), e análise nas regiões de células CD19 positivas com histogramas seqüenciais, foi possível identificar essa patologia, inclusive com discriminação de células residuais após terapêutica específica. Conclusão: A confirmação diagnóstica das leucemias de células cabeludas por citometria de fluxo é um método rápido, precisoe útil no laboratório clínico. A opção por um histograma inicial de CD19x SSC e análise de intensidade de expressão antigênica na medula óssea mostrou-se estatisticamente mais eficiente.

II Consenso Brasileiro de fator antinuclear em células HEp-2. Definições para a padronização da pesquisa de auto-anticorpos contra constituintes do núcleo (FAN HEp-2), nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico e suas associações clínicas / II Brazilian Consensus on antinuclear antibodies in HEp-2 cells. Definitions for standardization of autoantibody testing against the nucleus (ANA HEp-2), nucleolus, cytoplasm and mitotic apparatus, as wel as its clinical associations

Objetivo: O Segundo Consenso Brasileiro de Fator Antinuclear (FAN) em Células HEp-2 ratificou os algoritmos de decisão para leitura dos padrões do FAN na imunofluorescência indireta vistos na primeira edição do Consenso Brasileiro, adicionando ainda um novo algoritmo relacionado com os padrões mistos. Métodos: Tendo em vista a habilidade do teste em detectar auto-antígenos nos distintos compartimentos celulares, e não apenas no núcleo, propõe-se novas denominações para este exame laboratorial. Resultados e Conclusões: Como novas denominações algumas sugestões foram igualmente aceitas, dentro do tema "pesquisa de aut-anticorpos contra constituintes do núcleo (FAN HEp-2), nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico". Foram abordadas as principais relevâncias clínicas com os padrões de FAN descritos, facilitando o melhor uso do ensaio pelo médico

Avaliação de marcadores genéticos, ultra-sonográficos e bioquímicos frente à densitometria óssea na determinação da densidade mineral óssea em mulheres climatéricas / Avaliation of genetics, ultrasonographics and biochemical markers front to the bone densitometry in the determination of the bony mineral density in climateric women

O objetivo do estudo foi avaliar marcadores ultra-sonográficos, bioquímicos e gênicos associados à remodelação mineral óssea em mulheres climatéricas. Foi realizado estudo prospectivo durante um ano, que avaliou pacientes climatéricas matriculadas no Ambulatório de Ginecologia do Hospital das Clínicas da FMUSP. Foram excluídas pacientes que haviam feito reposição hormonal prévia, as que usavam drogas que afetam a remodelação óssea e as que apresentavam doenças crônicas ou eram tabagistas. Foram selecionadas 82 mulheres, com idade entre 45 e 60 anos, tempo de menopausa variando de um a 10 anos. As pacientes selecionadas foram submetidas à densitometria óssea, ultra-sonometria óssea, dosagens séricas de osteocalcina e urinária de cross-links de piridinolina. Foi realizado estudo de avaliação genética para determinação do polimorfismo do gene do colágeno tipo I alfa I (COLI AI). O densitômetro utilizado foi Hologic 4500A QDR, a ultra-sonometria óssea utilizou aparelho DBM Sonic 1200 IGEA.

Autoanticorpos anti-lipoproteína de baixa densidade oxidada na artrite reumatóide / Autoantibodies against oxidized low-density lipoprotein in rheumatoid arthritis

Objetivos: avaliar os níveis de anti-oxLDL e TBARS na AR e explorar suas correlações clínicas com atividade de doença, status funcional, anti-cardiolipina, anti-CCP e drogas. Métodos: 66 pacientes e 66 controles. Atividade de doença: DAS, VHS e PCR. Status funcional: HAQ. Anti-oxLDL: ELISA com LDL oxidada por cobre e ELISAs com peptídeos sintéticos da apo-B. TBARS: ensaio de TBARS. Anti-CCP e aCL: kits comerciais. Resultados: altos níveis de anti-oxLDL, TBARS, aCL e anti-CCP na AR. TBARS foi associado a atividade de doença. Pacientes em uso de cloroquina tiveram níveis mais baixos de anti-oxLDL.Purpose: to evaluate the levels of anti-oxLDL and TBARS in RA and explore the clinical associations with disease activity, functional status, anticardiolipin, anti-CCP and drugs. Methods: 66 patients and 66 controls. Disease activity: DAS, ESR and CRP. Functional Status: HAQ. Anti-oxLDL: copper-oxidized LDL ELISA and apo-B derived peptide ELISA. TBARS: TBARS assay. Anti-CCP and aCL: commercial kits. Results: higher levels of anti-oxLDL, TBARS, aCL and anti-CCP in RA. TBARS were associated to disease activity. Patients using chloroquine had lower levels of anti-oxLDL...